2 x Pfu PCR Mix

Mẫu A-1

■ Tiêu bản có chứa tạp chất protein hoặc chất ức chế Taq, v.v. ——Làm sạch khuôn mẫu DNA, loại bỏ tạp chất protein hoặc chiết xuất DNA khuôn mẫu bằng bộ dụng cụ tinh chế.

■ Sự biến tính của mẫu không hoàn toàn —— Tăng nhiệt độ biến tính một cách thích hợp và kéo dài thời gian biến tính.

■ Giảm tiêu bản —— Chuẩn bị lại tiêu bản.

A-2 Primer

■ Chất lượng mồi kém —— Tái tổng hợp mồi.

■ Phân hủy lớp sơn lót —— Chuyển các lớp sơn lót có nồng độ cao thành thể tích nhỏ để bảo quản. Tránh đông lạnh và rã đông nhiều lần hoặc bảo quản lạnh 4 ° C lâu dài.

■ Thiết kế sơn lót trong nhà (ví dụ như độ dài của lớp sơn lót không đủ, lớp sơn lót hình thành giữa các lớp sơn lót, v.v.) -Thiết kế lớp sơn lót (tránh hình thành lớp sơn lót và cấu trúc thứ cấp)

A-3 Mg²⁺nồng độ

■ Mg²⁺ nồng độ quá thấp ——Đặc biệt tăng Mg²⁺ nồng độ: Tối ưu hóa Mg²⁺ nồng độ bằng một chuỗi các phản ứng từ 1 mM đến 3 mM với khoảng thời gian 0,5 mM để xác định Mg tối ưu²⁺ nồng độ cho từng tiêu bản và mồi.

A-4 Nhiệt độ ủ

■ Nhiệt độ ủ cao ảnh hưởng đến sự kết dính của mồi và mẫu. —— Giảm nhiệt độ ủ và tối ưu hóa điều kiện với gradient 2 ° C.

A-5 Thời gian gia hạn

■ Thời gian gia hạn ngắn —— Tăng thời gian gia hạn.

Hiện tượng: Các mẫu âm tính cũng hiển thị các dải trình tự mục tiêu.

A-1 Nhiễm PCR

■ Nhiễm bẩn chéo đối với trình tự đích hoặc các sản phẩm khuếch đại —— Cẩn thận không dùng pipet lấy mẫu chứa trình tự đích trong mẫu âm tính hoặc làm tràn chúng ra khỏi ống ly tâm. Thuốc thử hoặc thiết bị phải được hấp tiệt trùng để loại bỏ các axit nucleic hiện có, và sự tồn tại của tạp nhiễm phải được xác định thông qua các thí nghiệm đối chứng âm tính.

■ Nhiễm bẩn thuốc thử —— Quét sạch thuốc thử và bảo quản ở nhiệt độ thấp.

A-2 Primer

■ Mg²⁺ nồng độ quá thấp ——Đặc biệt tăng Mg²⁺ nồng độ: Tối ưu hóa Mg²⁺ nồng độ bằng một chuỗi các phản ứng từ 1 mM đến 3 mM với khoảng thời gian 0,5 mM để xác định Mg tối ưu²⁺ nồng độ cho từng tiêu bản và mồi.

■ Thiết kế đoạn mồi không phù hợp và trình tự đích có sự tương đồng với trình tự không đích. ——Thiết kế lại lớp sơn lót.

Hiện tượng: Các dải khuếch đại PCR không phù hợp với kích thước mong đợi, lớn hoặc nhỏ, hoặc đôi khi xảy ra cả hai dải khuếch đại cụ thể và dải khuếch đại không cụ thể.

A-1 Primer

■ Tính đặc hiệu của mồi kém

——Thiết kế lại lớp sơn lót.

■ Nồng độ mồi quá cao ——Tăng nhiệt độ biến tính và kéo dài thời gian biến tính.

A-2 Mg²⁺ nồng độ

■ Mg²⁺ nồng độ quá cao ——Đặc biệt giảm nồng độ Mg2 +: Tối ưu hóa Mg²⁺ nồng độ bằng một chuỗi các phản ứng từ 1 mM đến 3 mM với khoảng thời gian 0,5 mM để xác định Mg tối ưu²⁺ nồng độ cho từng tiêu bản và mồi.

A-3 Polymerase có thể điều nhiệt

■ Lượng enzyme quá mức —— Giảm lượng enzyme thích hợp trong khoảng thời gian 0,5 U.

A-4 Nhiệt độ ủ

■ Nhiệt độ ủ quá thấp —— Tăng nhiệt độ ủ một cách thích hợp hoặc áp dụng phương pháp ủ hai giai đoạn

A-5 chu kỳ PCR

■ Quá nhiều chu kỳ PCR —— Giảm số chu kỳ PCR.

A-1 Primer——Đặc tính kém ——Thiết kế lại lớp sơn lót, thay đổi vị trí và độ dài của lớp sơn lót để nâng cao tính đặc hiệu của nó; hoặc thực hiện PCR lồng nhau.

DNA mẫu A-2

——Tiêu bản không tinh khiết ——Làm sạch tiêu bản hoặc tách chiết DNA bằng bộ dụng cụ tinh chế.

A-3 Mg²⁺ nồng độ

——Mg²⁺ nồng độ quá cao ——Đặc biệt giảm Mg²⁺ nồng độ: Tối ưu hóa Mg²⁺ nồng độ bằng một chuỗi các phản ứng từ 1 mM đến 3 mM với khoảng thời gian 0,5 mM để xác định Mg tối ưu²⁺ nồng độ cho từng tiêu bản và mồi.

A-4 dNTP

—— Nồng độ dNTP quá cao —— Giảm nồng độ dNTP một cách thích hợp

A-5 Nhiệt độ ủ

——Nhiệt độ ủ quá thấp ——Tăng nhiệt độ ủ một cách thích hợp

A-6 chu kỳ

——Quá nhiều chu kỳ ——Tối ưu hóa số chu kỳ

Bước đầu tiên là chọn polymerase thích hợp. Taq polymerase thông thường không thể đọc hiệu đính do thiếu hoạt tính exonuclease 3'-5 ', và sự không phù hợp sẽ làm giảm đáng kể hiệu quả kéo dài của các đoạn. Do đó, Taq polymerase thông thường không thể khuếch đại hiệu quả các đoạn mục tiêu lớn hơn 5 kb. Taq polymerase với sửa đổi đặc biệt hoặc polymerase có độ trung thực cao khác nên được lựa chọn để cải thiện hiệu quả mở rộng và đáp ứng nhu cầu khuếch đại đoạn dài. Ngoài ra, việc khuếch đại các đoạn dài cũng đòi hỏi sự điều chỉnh tương ứng về thiết kế mồi, thời gian biến tính, thời gian kéo dài, pH đệm,… Thông thường, mồi có 18-24 bp có thể dẫn đến năng suất tốt hơn. Để tránh làm hỏng mẫu, thời gian biến tính ở 94 ° C phải giảm xuống còn 30 giây hoặc ít hơn mỗi chu kỳ, và thời gian để tăng nhiệt độ lên 94 ° C trước khi khuếch đại phải ít hơn 1 phút. Hơn nữa, cài đặt nhiệt độ kéo dài ở khoảng 68 ° C và thiết kế thời gian kéo dài theo tốc độ 1 kb / phút có thể đảm bảo khuếch đại hiệu quả các đoạn dài.

Có thể giảm tỷ lệ lỗi của quá trình khuếch đại PCR bằng cách sử dụng các polymerase DNA khác nhau với độ trung thực cao. Trong số tất cả các polymerase DNA Taq được tìm thấy cho đến nay, enzyme Pfu có tỷ lệ lỗi thấp nhất và độ trung thực cao nhất (xem bảng đính kèm). Ngoài việc lựa chọn enzyme, các nhà nghiên cứu có thể giảm hơn nữa tỷ lệ đột biến PCR bằng cách tối ưu hóa các điều kiện phản ứng, bao gồm tối ưu hóa thành phần đệm, nồng độ polymerase ổn định nhiệt và tối ưu hóa số chu kỳ PCR.